Cómo funciona un microscopio

Abordaremos cómo funciona el microscopio: componentes y complementos. Cuando utilizamos un microscopio compuesto usamos cuatro tipos de lentes:

  • Condensadora (condensador) que se encarga de reunir los rayos e ilumina la muestra que estamos observando.
  • Objetivo enfoca estos rayos para crear una imagen real y mayor.
  • Ocular, que utiliza esta imagen para crear una imagen virtual aumentada. Ésta finalmente llega al cristalino del ojo humano, que es la cuarta lente, la que crea una imagen real e invertida.

La mayoría de los microscopios compuestos tienen varios objetivos colocados en un dispositivo rotatorio, el revólver. Éste permite alternar entre ellos. La mayoría de los microscopios actualmente son binoculares, es decir poseen dos oculares, que amplían la misma imagen. Los microscopios se llaman compuestos porque la imagen que ve el observador se ha formado en dos fases, no en una sola, como sucede en el simple.

Componentes y complementos

El objetivo del microscopio, que tiene las lentes de aumento, se debe colocar a una determinada distancia del objeto a visualizar, llamada enfoque. De esta forma  se obtiene una imagen clara y precisa. Esta distancia varía en función de las lentes de aumento que se usen. Las que tienen poco aumento se colocan a distancias mayores que cuando usamos las de grandes aumentos. Esta distancia es la que permite clasificar a los objetivos en el sistema inglés.

Para conseguir enfocar se utilizan dos sistemas que aproximan el tubo óptico al objeto:

  • El llamado macrométrico o enfoque grueso, que consigue una rápida aproximación, una visión poco definida.
  • Y el sistema micrométrico o enfoque fino, que produce un movimiento lento y delicado para conseguir lentamente una visión nítida.
Microscopio moderno con ambos enfoques en mandos horizontales próximos

Microscopio moderno con ambos enfoques en mandos horizontales próximos.

Sistema de enfoque ingles mediante cremallera en eje triangular y rueda sobre el tubo óptico

Sistema de enfoque inglés mediante cremallera en eje triangular y rueda sobre el tubo óptico.

Enfoque europeo con cremallera en eje cuadrado.

Enfoque europeo con cremallera en eje cuadrado.

Microscopio con enfoque con cremallera y enfoque fino mediante rueda horizontal

Microscopio con enfoque con cremallera y enfoque fino mediante rueda horizontal

Microscopio con enfoque con cremallera y enfoque fino mediante rueda horizontal 

En general el enfoque se consigue aproximando el tubo óptico al objeto situado en la platina del microscopio. Sin embargo, se desarrollaron modelos en los que el tubo óptico es fijo y el enfoque se consigue elevando o bajando la platina del aparato. Es lo que se denomina enfoque inverso. Este tipo de enfoque se utilizó especialmente en Francia durante el siglo XIX, muestra de ello son los microscopios de esta colección nº48, 52, 52c, 25 y 52f. Estos dos últimos se muestran a continuación.

Se trata de un sistema de enfoque inverso mediante la elevación de la platina, en vez de moverse el tubo óptico que en estos aparatos está fijo.
Se trata de un sistema de enfoque inverso mediante la elevación de la platina, en vez de moverse el tubo óptico que en estos aparatos está fijo.

Se trata de un sistema de enfoque inverso mediante la elevación de la platina, en vez de moverse el tubo óptico que en estos aparatos está fijo.

A la izquierda, Cary-Gould, a la derecha Lerembours. En las imágenes inferiores, a la izquierda, el Sistema de George Merz; a la derecha, el de Benjamin Martin, ambos S.XVIII.

A la izquierda, Cary-Gould, a la derecha Lerembours. En las imágenes inferiores, a la izquierda, el Sistema de George Merz; a la derecha, el de Benjamin Martin, ambos S.XVIII.
A la izquierda, Cary-Gould, a la derecha Lerembours. En las imágenes inferiores, a la izquierda, el Sistema de George Merz; a la derecha, el de Benjamin Martin, ambos S.XVIII.

Inicialmente, los microscopios montaban un objetivo único y para conseguir un mayor aumento había que sustituirlo por otro de más potencia. Este es el caso del microscopio nº 45 de Culpeper de 1740. Pronto se diseñaron modelos que permitían incrementar los aumentos mediante la aposición, mediante un mecanismo de rosca de varias lentes de más aumentos. Un ejemplo de ello son el microscopio nº 45a fabricado en 1780, o el nº48 de 1840 de esta colección.

Arriba objetivo formado por varias lentes que se unen a rosca para incrementar el aumento de la imagen

Objetivo formado por varias lentes que se unen a rosca para incrementar el aumento de la imagen

Arriba objetivo formado por varias lentes que se unen a rosca para incrementar el aumento de la imagen
Microscopio simple con tres lentes enroscadas.

Objetivo formado por varias lentes que se unen a rosca para incrementar el aumento de la imagen

Diferentes objetivos de un microscopio.

La mayoría de los microscopios modernos vienen dotados de varios objetivos. Cada uno de diferente aumento, que pueden usarse alternativamente. Para facilitar el cambio están montados en una pieza giratoria horizontal, denominada revólver portaobjetivos. Éste está construido de manera que el objetivo que se está usando tiene su eje óptico alineado con el del ocular y también con el del condensador. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina.

Cada objetivo es un objeto cilíndrico que contiene una serie de lentes coaxiales. Es decir, tienen sus ejes alineados para producir una ampliación. De esta manera, se evitan dos problemas de la ampliación de la imagen por una lente: por un lado la aberración esférica y por otro la aberración cromática. Un objetivo se califica como acromático si corrige la segunda, evitando cercos de color, y planacromático, si corrige adecuadamente las dos. En la mayoría de los casos, la corrección de aberraciones se logra por el trabajo combinado de objetivo y ocular.

Los objetivos se distinguen principalmente por la ampliación que está previsto obtener con ellos y por su poder de separación. Es decir la capacidad de ver dos puntos como distintos: su resolución. El poder separador depende de un parámetro llamado apertura numérica (AN). Los objetivos destinados a ampliaciones más pequeñas (típica -mente 4X) la tienen de 0,10; los de mayor ampliación (100X) tienen A.N. de 1,25. Cuanto mayor es la ampliación que consigue un objetivo, más debe acercarse éste a la muestra para poder visualizarla. Incluso en objetivos de mediana ampliación, como 40X, la distancia es inferior a un milímetro. En un microscopio, la operación de enfocar consiste en ajustar esta distancia.

Los objetivos de 100 aumentos (100X), y más raramente otros de menor ampliación, suelen ser objetivos de inmersión (y llamamos a los que no lo son objetivos secos). Para el uso de éstos hay que crear entre la muestra y la lente frontal del objetivo, un medio con un índice de refracción continuo (el índice de refracción de un medio transparente mide el grado de desviación que provoca en los rayos luminosos). Para ello se pone sobre la muestra una gota de aceite (clásicamente «aceite de cedro») y se acerca el objetivo a la muestra hasta que su lente frontal queda sumergida en la gota. En la mayoría de los casos entre el objeto observado (por ejemplo una bacteria) y la lente frontal estarán, en este orden, el medio de montaje (una gelatina o una resina), el vidrio cubreobjetos y, por último, el aceite de inmersión. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.

Las características de un objetivo suelen estar grabadas en un lateral. Estas son el poder de ampliación (por ejemplo 40X), la abertura numérica (por ejemplo, 0,65), y la distancia a la que proyecta la imagen (por ejemplo 160, porque se da en milímetros). La longitud del tubo óptico y los oculares deben estar ajustados a la misma distancia de proyección. La lente frontal del objetivo es siempre muy pequeña, menor cuanto mayor su poder de ampliación, y su diámetro es inferior a un milímetro en los objetivos más potentes.

Objetivos con collar de corrección

Los collares de corrección se utilizan en objetivos de gran potencia que trabajan en seco. La corrección es necesaria ya que la mayoría son diseñados para hacer observaciones con cubres de 0.17 mm, el grosor más habitual. Pero no todos lo tienen igual. De hecho, hay 4 grosores estándar numerados como 0, 1, 1.5 y 2.
En el siglo XIX estos grosores eran muy variables. Cuando se utilizaban objetivos con aperturas numéricas altas (iguales o superiores a 0.8), unas pocas micras ocasionaban degradaciones importantes de la imagen. Es decir aberraciones cromáticas o esféricas. Los collares se utilizaban para corregir estas distorsiones, al ajustar la posición de las lentes centrales dentro del objetivo.

J.J. Lister fue el primero en detectarlo en la década de 1820 pero no fue hasta 10 años más tarde que uno de sus colaboradores, Andrew Ross, presentó en la Royal Society o fArts el primer modelo. Había objetivos con collar de corrección de dos tipos: los que intentaban suplir la falta de cubreobjetos (Covered/Uncovered) y los que estaban graduados para corregir exactamente distintos grosores.

Paralelamente, Lister construyó las primeras lentes acromáticas junto a Hugh Powell y James Smith. El primero se unió a Lealand (Powell&Lealand) y el segundo a Beck (Smith&Beck) y los 3 grupos crearon la Royal Microscope Society. Ésta impulsó y estandarizó tanto los microscopios como las lentes. Más abajo se exponen algunos ejemplos de objetivos con collares de corrección de importantes fabricantes, reproducidos por la amabilidad de Xavier Garces.

El Sistema Inglés

Acabamos de ver que el sistema europeo de clasificación de los objetivos, se fundamenta en el número de aumentos que se consigue con ese objetivo a mayor poder de aumento, distancia de observación, distancia entre la lente del objetivo y la muestra a observar. El aumento es menor, es decir a mayor poder de aumento menor distancia. Los fabricantes ingleses se fundamentan en el mismo principio pero lo expresan por esa distancia, clasificando los objetivos por ese espacio en pulgadas (inches): 4 ,2 ,1 ,2/3, 1/2, 1/4, 1/6, 1/8, 1/12 y 1/16 (los tres últimos se utilizan como objetivos de inmersión). La equivalencia aproximada de los dos sistemas sería: distancia pulgadas :2 ,1, 2/3 ,1/6 ,1/8, 1/12, 1/16; aumentos (x): (x2,5),(x6), (x10), (x40), (x60), (x90), (x100).

El papel del ocular

En el extremo superior del tubo óptico, el de observación, donde se aproxima el ojo, se sitúa el ocular. Éste posee forma cilíndrica y contiene generalmente, como el objetivo, varias lentes coaxiales. A diferencia del objetivo, no se atornilla, sino que se encaja en el tubo óptico como un émbolo, sostenido por su peso, y contenido por un reborde de mayor diámetro en su extremo superior.

Cada ocular lleva grabadas sus características, pero en especial su poder de ampliación. Se expresa como en el caso de los objetivos con un número seguido del signo de multiplicación (x). Los oculares más usados son los de 10x, pero también los 4x ,5x y los 15x. La ampliación total de una observación se obtiene multiplicando la del objetivo por la del ocular. Por ejemplo, con un objetivo de 100X y un ocular 15X, obtenemos una ampliación de 1.500 aumentos (1.500X), que es por cierto la máxima ampliación obtenible, dadas las limitaciones de resolución de los objetivos.

Modelo universal de Beck & Beck con una rueda intercambiadora de oculares. Fue un dispositivo que tampoco se hizo popular.

Modelo universal de Beck & Beck con una rueda intercambiadora de oculares. Fue un dispositivo que tampoco se hizo popular.

Conjunto de oculares intercambiables. Este curioso dispositivo desarrollado por Leitz en Alemania permitía intercambiar los tres oculares de diferentes aumentos, fue un invento de poco éxito

Conjunto de oculares intercambiables, desarrollado por Leitz en Alemania.

La mayoría de los microscopios escolares y de aficionado son monoculares. Pero los de trabajo (por ejemplo, los usados para examinar muestras médicas) y los de investigación, son binoculares. En éstos los rayos luminosos producidos por el objetivo se desdoblan por medio de prismas para dar servicio a dos oculares. De manera que se observa con los dos ojos a la vez. A diferencia de lo que ocurre con unos prismáticos o gemelos de visión lejana (o con el tipo de microscopio compuesto que llamamos lupa binocular) los dos ojos ven exactamente la misma imagen, sin ningún efecto de relieve.

Sistema de iluminación

Tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial para iluminar la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Puede ser de dos tipos:

  • Iluminación incidente: aquella que permite que los rayos de luz incidan sobre la muestra a observar. Puede ser sencillamente la luz ambiente o la luz incidente conseguida por lentes plano-convexas que concentran los rayos sobre el objeto colocado en la platina, son las lentes llamadas “ojo de buey” (bull´s eye).
  • Iluminación por transparencia: inicialmente se trató clásicamente de un espejo situado en la parte inferior del microscopio. Este suele tener dos caras, una con un espejo plano y otro de superficie cóncava, que permite la concentración de los rayos de luz. Como foco de luz, se utilizó la llama de una vela y con posterioridad la de una lampara especial de petróleo o gas.  Ya en el siglo XX de utilizaron lámparas eléctricas y más recientemente incandescentes de tungsteno de alto voltaje y las más modernas con leds.
grabado con los complementos de un microscopio. El microscopio: componentes y complementos

Grabado con los complementos de un microscopio

Antes de llegar la luz al objeto a observar, delante de ella se sitúa un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo. Ello controla el diámetro de la parte de la preparación que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observación produciendo luces parásitas. El condensador está formado por un sistema de lentes, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. Se sitúa debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación).

Esquema de las lentes de dos condensadores.
Un condensador simple con diafragma en iris, que se maneja con la lengüeta que se sitúa a la derecha.

Existen condensadores de inmersión, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajándose para su uso con objetivos de poca potencia.

El espejo es necesario si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio y alineada con el sistema óptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos más modernos no poseen espejos, sino una lámpara que cumple la misma función que el espejo.

La linterna sustituye al espejo en diferentes tipos de microscopios. Tiene la función de iluminar la muestra mejor que usando el espejo. Esto es porque más cantidad de luz pasa a través de la muestra. Al principio, fueron velas o lamparillas de petróleo y más tarde de gas hasta que llegó la electricidad.

Inicialmente, la única forma de regular la intensidad de la iluminación por trasparencia se conseguía mediante la interposición de un diafragma. Este reduce o amplia el rayo de luz. El condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste. Lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico. En el pasado, se utilizaba un agujero reductor del rayo de luz. Posteriormente, se realizaban los agujeros en un círculo metálico con distintos diámetros, lo que se denominó rueda de diafragmas. Finalmente, este se sustituyó por un diafragma iris.

Otras soluciones que se inventaron para regular la luz fue este curioso dispositivo a mano derecha con dos aberturas practicadas en una lengüeta bajo la platina, que se mueve lateralmente ofreciendo dos posibilidades de regulación.

Lujoso sistema de condensador y diafragma.

Lujoso sistema de condensador y diafragma.

Un condensador con diafragma incorporado de Powell & Lealand famosos ópticos ingleses del siglo XVIII.

Un condensador con diafragma incorporado de Powell & Lealand famosos ópticos ingleses del siglo XVIII.

Pantalla reflectante que se coloca en la platina

Pantalla reflectante que se coloca en la platina

Base, pie o estativo

Se trata del soporte estable del microscopio. Constituye la base sobre la que se eleva y sostiene el resto del aparato. Es el componente que ha cambiado más a lo largo de la evolución de este aparato.  Finalmente posee una sola forma, la de herradura, que fue adoptada por todos los fabricantes.

La base de apoyo de los primeros aparatos era generalmente circular, bien de madera o latón. Este es el caso de los modelos Culpeper. También en los microscopios simples y los portátiles servía de estativo el propio estuche del aparato. Posteriormente se diferencian  tres tipos de diseño: los microscopios de tambor, los modelos de pie inglés y los modelos europeos, de pie continental o de herradura.

Dos modelos de tambor de mediados del siglo XIX, el de la izquierda con una base circular pequeña y el de la derecha con una base mayor relle na de plomo para hacerla más estable.

Dos modelos de tambor de mediados del siglo XIX, el de la izquierda con una base circular pequeña y el de la derecha con una base mayor rellena de plomo para hacerla más estable.

Evolución del microscopio de tambor desde su modelo más simple

Evolución del microscopio de tambor desde su modelo más simple

a)Los microscopios de tambor(drum) o barril (barrel), tienen una base circular de pequeño diámetro. Posteriormente, el tamaño de base aumentó para hacerlos más estables y se rellenaron de plomo.

b) Los microscopios de pie inglés, suelen tener tres o cuatro patas más o menos abiertas para conferirles estabilidad. El prototipo que se hizo más popular fue el pie de Crouch. Este posee tres patas, dos delanteras y una trasera, amplia y en curva. Pero este mismo fabricante diseñó modelos con al menos cinco tipos de estativos diferentes a este. Desde uno circular para el modelo universal hasta de trípode plano y garra de águila (“clawfoot”). En Inglaterra cada una de sus numerosas empresas diseñó sus propios estativos, siendo numerosísimos los modelos que existen.

El otro gran fabricante inglés que diseñó numerosos modelos de estativo para sus microscopios fueron los hermanos Beck. Al menos existen más de seis diseños, algunos de ellos realizados con extraordinaria imaginación.

Modelo binocular “Premier” posiblemente fue para este extraordinario modelo para el que Henry Crouch diseñó su famoso pie de trípode en 1870.Este modelo fue publicado en el Journal of Microscopy.
Un binocular con pie en garra de águila invertida.
Un modelo con pata trasera simple.
Un modelo con pata trasera simple.

En la imagen superior el modelo economic with glass stage de Beck&Beck en su versión monocular y binocular. Su estativo es de tres patas horizontales a 120º.

Modelo “educacional” de B&B su estativo es la madera que forma parte de su estuche.

Modelo “educacional” de B&B su estativo es la madera que forma parte de su estuche.

Modelo serie Star, el pie es un solo bloque de acero pavonado gris

Modelo serie Star, el pie es un solo bloque de acero pavonado gris

Modelo serie Star con un pie articulado.

Modelo serie Star con un pie articulado.

Dos estativos de modelos de Beck & Beck tienen forma de herradura pero el aparato de la derecha tiene una prolongación posterior.

Estativo de modelos de Beck & Beck tienen forma de herradura.

Complementos

Actualmente, el microscopio es un aparato que se integra en los laboratorios como un instrumento más dentro del mismo. Las muestras que se estudian han sido preparadas según procedimientos y técnicas en las que se implican numerosos dispositivos y pequeños aparatos multifuncionales.

Sin embargo, en sus principios en los siglos XVIII y XIX, el microscopio fue un nuevo instrumento manejado, en la mayoría de las ocasiones, por personas curiosas o aficionadas a la naturaleza. Estos, lógicamente, carecían de los instrumentos e instalaciones para preparar las muestras a observar. Por ello los primeros aparatos se acompañaban de un mínimo de instrumentos o complementos para poder utilizar prácticamente los microscopios.

Los tres pequeños instrumentos indispensables para realizar observaciones de muestras tomadas directamente de la naturaleza son: las pinzas (fórceps), las agujas con mango de hueso o marfil y las pequeñas pinzas fijas o de presión continua, que se instalaban mediante un eje en el borde de la platina. Éstas últimas permitían sujetar pequeñas muestras. Estos tres instrumentos podemos observarlos en la figura inferior en un microscopio portátil de Whitering y en el esquema de un primitivo modelo de Culpeper.

Otros dos pequeños instrumentos que acompañaban al microscopio solían ser: los portaobjetos para colocar las muestras para su observación.  Eran piezas rectangulares de hueso o marfil con tres o cuatro orificios con un fondo trasparente, muy fino, de mica y sobre el que se depositaban las muestras a observar. El siguiente aparato que era indispensable era el live box o cajita para observar organismos vivos. Solía ser de latón con un orificio central con fondo de cristal y paredes elevadas para que no escapara el pequeño animal. También se hicieron cajas con las paredes de cristal y bordes de latón. En las dos imágenes inferiores podemos observar: en la primera que corresponde a un modelos Culpeper, varios portaobjetos y dos pinzas, una de ellas de tipo fijo. En la segunda cuatro tipos de “live box”.

cuatro tipos de “live box”.

Cuatro tipos de “live box”.

modelos Culpeper, varios portaobjetos y dos pinzas, una de ellas de tipo fijo.

Modelos Culpeper, varios portaobjetos y dos pinzas, una de ellas de tipo fijo.

Los sistemas de iluminación constituyeron un grupo muy importante de complementos para conseguir luz incidente. Se desarrolló un tipo de lente plano-convexa denominada “ojo de buey” (bull´s eye) que consigue la convergencia de los rayos de luz sobre el objeto en observación.

Los dispositivos con estas lentes podemos clasificarlos en: independientes, con pie, de un tamaño considerable con lentes de hasta siete centímetros de diámetro. El otro tipo, de menor tamaño, se fijaban en el propio aparato, bien en la parte frontal en el tubo óptico o más frecuentemente en el borde la platina.

sistemas de iluminación microscopio
Conjunto de complementos de un gran microscopio inglés.

Conjunto de complementos de un gran microscopio inglés.

Conjunto de complementos del modelo “Premium” de Henry Crouch. Estos complejos y costosos equipos eran extraordinarios regalos para personas de elevado nivel social y que usualmente no los utilizaban, por lo que han llegado hasta nosotros en un estado impecable sin señales de uso.( Nº 92 de la colección Perea Borobio).

Conjunto de complementos del modelo “Premium” de Henry Crouch. Estos complejos y costosos equipos eran extraordinarios regalos para personas de elevado nivel social y que usualmente no los utilizaban, por lo que han llegado hasta nosotros en un estado impecable sin señales de uso.( Nº 92 de la colección Perea Borobio).

Equipo de filtros para el diafragma de este condensador complejo.

Los otros dos dispositivos son el espejo de Lieberkühn, una superficie circular cóncava que rodea al objetivo y centra su iluminación sobre el punto de observación (en la lámina inferior son el numero 11). El otro es una sección de un espejo cóncavo de superficie reflectante que mediante una extensión se maneja para iluminar el portaobjetos y que se fija a la platina mediante un vástago.